Рекомендации по таксономической идентификации микроорганизмов для целей депонирования в БРЦ ВКПМ

Для депонируемого штамма должна быть приведена таксономическая идентификация до вида. При установлении видовой принадлежности микроорганизма рекомендуем следующую последовательность действий.

1 Первый этап – анализ последовательности рибосомального маркера:

Секвенирование нуклеотидной последовательности рибосомального маркера:

- для прокариот — гена 16S рРНК;

- для эукариот — региона ITS (реже — участков 28S или 26S рРНК).

Требования к последовательности:

- длина — не менее 400–500 пар оснований;

- гомология с референтной последовательностью типового штамма — не менее 97%.

Примечание: чем длиннее анализируемый фрагмент, тем выше может быть процент требуемой гомологии для отсечения неподходящих

видов.

В отчете необходимо представить последовательность исследуемого маркера в текстовом формате (будем ли просить предоставить FASTA?)

2 Дополнительная верификация (при неоднозначных результатах первого этапа)

Если полученного уровня гомологии не достаточно для однозначного отнесения к виду (например, несколько видов демонстрируют сходный процент сходства), необходимо представить результаты дополнительных уточняющих тестов, позволяющих сделать окончательное заключение.

Такие тесты могут включать:

-фенотипические исследования;

-физиологические характеристики;

-анализ последовательностей дополнительных молекулярных маркеров.

В отчете необходимо представить ссылки на соответствующую литературу.

3. Краткий обзор существующих методов идентификации

3.1. Описание фенотипических свойств

Фенотипические исследования представляют собой важный этап идентификации, позволяющий предварительно отнести организм к крупной таксономической группе.

Морфологические и культуральные признаки

форма клеток (кокки, палочки, извитые формы);

характер расположения клеток;

способность к спорообразованию;

```
тип жгутикования;
```
```
окраска по Граму;
```

характер роста на питательных средах (цвет, форма, размер колоний, пигментация).

Физиолого-биохимические признаки

потребность в кислороде;

способность ферментировать углеводы;

наличие специфических ферментов (например, каталазы, оксидазы);

отношение к температуре и pH;

синтез пигментов и токсинов.

Фенотипические характеристики культуры должны быть внесены в паспорт, не обладают достаточной информативностью для окончательной идентификации.

3.2. Молекулярные методы - база современной систематики/идентификации.

3.2.1. Анализ последовательностей рибосомальных маркеров (16S рРНК, ITS, D1/D2)

Это основной метод для установления рода и вида.

Сравнение последовательности гена 16S рРНКс данными референтных баз позволяет построить филогенетическое дерево для прокариот.

Уровень сходства менее 98,7–99% часто указывает на принадлежность к разным видам (конкретный порог зависит от длины сравниваемой последовательности).

Однако, в связи с развитием методов идентификации и систематики для разделения близких видов в некоторых крупных таксономических группах (например, Bacillus, Pseudomonas, Fusarium и др.) гомологии полного гена рибосомального маркера выше 98–99 % уже недостаточно.

3.2.2. Мультилокусное типирование (MLST)

Метод основан на определении нуклеотидных последовательностей коротких фрагментов (около 500 п.н.) ряда генов и последующем сравнении с базами данных.

Чаще всего анализируются гены «домашнего хозяйства» (housekeeping genes), необходимые для основного метаболизма и присутствующие у всех организмов.

Метод удобен в качестве дополнительного инструмента при неоднозначности анализа рибосомальных маркеров.

Для каждой трудноразделимой группы, как правило, существует свой наиболее информативный маркер.

(В отчете необходимо представить ссылки на литературу и привести праймеры.)

3.2.3. Видоспецифические праймеры (на маркерные гены)

По сути, является продолжением предыдущего подхода, но не может служить самостоятельным методом идентификации.

Хорошее дополнение при неоднозначности анализа рибосомальных маркеров.

Эффективен при разделении конкретных групп организмов.

Значительно быстрее, чем секвенирование маркерных генов.


При использовании данного метода необходимо предоставить ссылки на литературу, в которой описано применение указанных праймеров для целевой группы микроорганизмов.

3.2.. Полногеномное секвенирование (WGS)

Позволяет определять видовую принадлежность путём сравнения полного генома с открытыми базами данных типовых штаммов.

(В работу принимаются автоматически сформированные отчеты известных программ или ссылка на депонированный в международный генбанк геном)

3.3. Современные экспресс-методы

3.3.1 MALDI‑TOF масс‑спектрометрия

Метод позволяет получать уникальный белковый профиль микроорганизма, который затем сравнивается с базой данных.

```
Очень быстрый метод.
```

Широко применяется в клинической диагностике.

(В работу  спектр белкового профиля или автоматически сформированный отчет)

3.3.2 Системы фенотипического профилирования

```
BioLOG
```
```
API‑тестыи их аналоги
```

Имеют ограничения:

Сильная зависимость от актуальности и полнотыиспользуемых баз данных.

Сложность интерпретации «специфических» результатов.

Данные системы могут использоваться как дополнительный источник информации, но не как основа для окончательной идентификации.